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定量ウェスタンブロッティングの新定番
Stain-Free定量ウェスタンブロッティング スターターパック
ウェスタンブロッティ ングにおけるデータ補正法のトレンド
従来、 ウェスタンブロッティングの量的変化を評価する際、 データの信頼性を担保するためにターゲッ トタンパク質に加えハウスキーピングタンパク質 評価する方法が一般的に用いられてきました。 しかしながら一般的なハウスキーピングタンパ (HKP : House Keeping Protein) を同様に検出し、 ク質はターゲッ トタンパク質と比べ発現量が高い場合が多く、 また、 実験条件やサンプルの状態によって発現量が変動するなどの報告 (Bulletin6350 参照) がされるようになりました。 その代替法として総タンパク質を用いた評価法が着目されてい このような背景もあり、 近年では HKP を用いた評価法の利用は慎重になりつつあり、 ローディングコントロールと ます。 すでにいくつかのジャーナルでは、 HKP を用いる代わりに総タンパク質を用いることが推奨されていることもあり、 して総タンパク質が用いた評価法を目にする機会が増えています。 バイオ・ラッ ドではこの総タンパク質を用いる方法として、 Stain-Free テクノロジーを応用した “Stain-Free 定量ウェスタンブロッティング ” をご提案 しています。この 方 法 は 従 来 のメンブレン染 色 法と比 べ、簡 便 にメンブレン上 の 総タンパク質デ ータを得ることができ、多くの 研 究 論 文 で使用例が報告されています。 (Bulletin6351 参照)
HKP の発現安定性に関する論文リスト Stain-Free テクノロジーを用いたデータ補正が使用された論文リスト
Bulletin6350 Bulletin6351
Stain-Free テクノロジーと総タンパク質検出法
バイオ ・ ラッ ド独自のゲル (TGX Stain-Free ゲル) には、 トリハロ化合物 タンパク が含まれており、 電気泳動を行った後、 UV 光を照射することで、 質内のトリプトファン残基と共有結合します。 この修飾を受けたトリハロ この技術を利用する 化合物は UV 光を照射することで蛍光を発します。 ことで、 転写後のメンブレン上の総タンパク質検出も可能になります。 メンブレン上の総タンパク質を用いた検出は右表に示すようにいくつか ありますが、 Stain-Free テクノロジーを用いた検出法は十分な検出感 度と優れた操作性を兼ね備えた方法と言えます。
Stain-Free Western Blotting with ChemiDoc MP Imaging System
メンブレン上の総タンパク質検出法の比較
CBB/ アミド
ブラック 可視 〇 高 〇 低 検出方法 感度 抗原抗体反 応への影響 操作性 コスト
Ponceau S
可視 △ 低 〇 低
SYPRO Ruby
蛍光 ◎ 低 × 高
テクノロジー 蛍光 〇 低 〇 低
Stain-Free
Stain-Free TGX ゲルの詳細は 32 ページへ
Stain-Free を用いた総タンパク質補正 Stain-Free 定量ウェスタンブロッティング の流れ
①通常通りサンプル調製し、 電気泳 動
②泳動後のゲルに UV 照射し、 電気 泳動パターンの確認
③転写後のメンブレンに UV を当 て、 転写状態の確認
④従来通り抗原抗体反応を行い、 化学 発光検出によりターゲット分子を 検出
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⑤ ImageLab 解析ソフトウェアにより総タンパク 質およびターゲッ トタンパク質を数値化、 および データノーマライズを実施
従来のウェスタンブロッティングでは最終工程の検出まで実験がうまくいっているかどうかの判断は難しく、 トラブルが発生した際の原因究明が難航す るケースがあります。 Stain-Free 定量ウェスタンブロッティングは、定量的なデータ補正データの取得のほか、 ·電気泳動後に泳動パターンを確認 ·ブロッティング後に転写状態 (転写効率) の確認 を行うことができるため、 実験中のトラブルの的確な把握により実験効率の向上も可能です。
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Bio-Rad Laboratories
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